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更新時(shí)間:2025-09-19
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在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)研究中,免疫共沉淀 (Co-IP)和免疫沉淀 (IP)實(shí)驗(yàn)是探索蛋白 質(zhì)相互作用、驗(yàn)證靶蛋白結(jié)合關(guān)系的關(guān)鍵技術(shù)。無論是研究信號(hào)通路、蛋白復(fù)合物,還是疾病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò),IP/Co-IP 都能提供直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù),幫助科學(xué)家深入解析生命活動(dòng)的分子機(jī)制。本期內(nèi)容將系統(tǒng)梳理IP/Co-IP 實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)步驟以及如何分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
一、實(shí)驗(yàn)原理
免疫沉淀/免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)的方法。 在免疫沉淀中,通過特定抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗體—抗原復(fù)合物,再利用沉淀的方法將其 從混合物中分離出來,從而純化目標(biāo)蛋白。而免疫共沉淀可以檢測(cè)兩個(gè)已知蛋白之間的相互作用。當(dāng)用預(yù)先固化在beads上的蛋白質(zhì)A 的抗體免疫沉淀A 蛋白,那么與A 蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B 也能一起沉淀下來。
①用proteinA/G連接抗體,然后用抗體去抓目的蛋白

②beads上已經(jīng)偶聯(lián)了標(biāo)簽抗體,可以直接抓目的蛋白
二、實(shí)驗(yàn)流程
樣品制備
植物樣本:分成小塊后用液氮研磨粉碎,然后加入裂解液(加蛋白酶抑制劑)冰上/借助超聲裂解合適 的時(shí)間,離心取上清。
動(dòng)物細(xì)胞:棄去培養(yǎng)基,用PBS 洗幾次,然后加入裂解液(加蛋白酶抑制劑)冰上裂解合適的時(shí)間, 離心取上清。
動(dòng)物組織:剪碎后加入裂解液(加蛋白酶抑制劑),然后用勻漿器勻漿,裂解充分后離心取上清。
平衡beads
用TBS 等緩沖液或者裂解液清洗beads3-5 次,將beads 中的保護(hù)液替換成實(shí)驗(yàn)中緩沖液體系,避免影 響下游實(shí)驗(yàn)。
孵育
方法一:抗體和磁珠先孵育
選擇經(jīng)過IP驗(yàn)證的抗體,可以減少失敗的可能性,此外抗體的用量也較為重要,抗體用量過少不 利于后續(xù)抗原結(jié)合,而抗體過多就不能完quan吸附在beads 上,造成浪費(fèi),一般建議抗體使量為 2-5ug 即可。抗體和beads 室溫孵育30-60min 或4℃孵育1-2h后,吸棄上清,加入裂解后的樣品共孵育。
注:若使用已經(jīng)偶聯(lián)好標(biāo)簽抗體的beads,則可以直接和裂解好的樣品孵育,不用偶聯(lián)抗體。
方法二:抗體和抗原先孵育
抗體和抗原先進(jìn)行孵育,然后抗體抗原復(fù)合物與beads進(jìn)行孵育。
洗雜
用裂解液或PBS 洗滌沉淀,2500rpm (約1000g)離心5min, 或瞬時(shí)高速離心,小心吸除上清,重復(fù)此 步驟3-5次。這一步是為了洗去未結(jié)合的雜蛋白。
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